銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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動物實驗、載體構建、細胞實驗、病理學檢測、免疫沉淀、核酸蛋白分析

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穩轉株構建

Stable strain



實驗原理


在基因功能的研究中,將目的基因有效導入靶細胞,是功能研究的前提條件之一。根據不同的實驗需求可以選擇瞬時轉染/感染和穩轉細胞株構建。

瞬時轉染/感染的特點:外源DNA不整合到宿主的染色體中,一個宿主細胞中可以存在多個拷貝數,產生短時間內的高水平的表達(只能持續幾天);外源基因的表達水平不存在整合位點的問題,不會受到周圍染色體元件的影響;瞬時轉染所需的人力和時間比穩轉少,但DNA攝入效率和表達水平在不同實驗中差異較大,因此表達不長久也不穩定。

穩轉細胞株的特點:經合適的藥物濃度進行藥物篩選后,可得到外源DNA整合到宿主染色體的細胞這些細胞可以長時間表達外源目的基因,穩定表達細胞株彌補了瞬時感染(或轉染)實驗中外源基因表達時間短的缺陷,便于長期觀察。穩轉細胞的篩選需根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物,常用的抗性篩選有嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)、滅稻瘟素(Blasticidin)等。若實驗需求構建穩轉細胞株,我們建議通過慢病毒感染細胞進行藥物篩選的方法,此方法較質粒轉染可以更加有效的將外源基因整合入基因組,且整合位點處于轉錄相對活躍的區域,從而獲得更加高效表達外源基因的穩轉株細胞。


技術應用


如秩序要觀察外源基因表達后較短時間內就能檢測的細胞功能,可使用瞬時轉染/感染。即在轉染后2496小時內收獲細胞;如需要長期觀察外源基因表達的作用,進行長期藥理學研究、基因治療研究、遺傳調控機制研究或需要進行大規模蛋白合成則需要構建穩轉株。


實驗流程





實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

細胞株(凍存株/培養細胞),目的

基因的質粒/菌株,目的蛋白抗體

目的基因的NIBI登錄號、目的基因的載體信息、細胞培養信息

15周

我們提供

穩轉細胞株T25一瓶和其凍存株一支

基本實驗步驟、細胞培養,篩選照片以及qPCR和WB檢測結果


實驗結果展示


圖 1 穩轉細胞株成功案例


TROUBLESHOOTING

實驗問題

原因

推薦解決方法

GFP陰性對照慢病毒感染細胞無熒光?


細胞狀態不佳

細胞狀態調整良好且細胞密度合適。

病毒感染細胞條件不適合

采用梯度濃度的慢性毒感染細胞,摸索合適的病毒感染細胞的比例,并考慮是否加polybrene

穩轉細胞株狀態變差?

傳代次數過多

采用10代以內的細胞盡快完成實驗,盡量防止反復凍存復蘇操作。

穩轉細胞株中表達GFP的細胞變少?

出現非抗性細胞

適當增加抗生素濃度。

質粒轉染細胞效率過低?

質粒DNA的純度

無內毒素污染的高純度的質粒。

轉染試劑

選擇適合靶細胞的轉染試劑并摸索轉染試劑與質粒的混合比例。

細胞狀態

細胞狀態良好,細胞密度適合。

更換基因導入方式

更換基因導入方式對于難轉染細胞建議采用病毒介導。


常見問題 FAQ


Q:外源基因導入哺乳動物細胞的常見方法 有哪些?

A外源基因導入哺乳動物細胞是目前基因治療的關鍵步驟,理想的方法應具備如下特點:高效、安全、低細胞毒性且方法簡單省時、經濟。常見方法及比較請見下表:


常見方法

原理

優缺點

脂質體轉染

帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞。

最常用的轉染方法,體外對部分細胞有很高的效率;在體內迅速被血清清除,會產生一定毒性。

陽離子聚合物轉染

陽離子聚合物可以與DNA形成穩定的復合物保護DNA免受核酸酶的降解。

日益收到重視,但受到細胞類型的局限,出現轉染效率不高和細胞毒性的情況。

納米聚合物轉染

納米級別的高分子陽離子聚合物可與DNA混合形成納米復合物。

更加高效安全且細胞毒性低,更有獨特的熒光示蹤功能,各個公司已推出商品化產品,能否使用各種難轉染細胞還有特驗證。

病毒感染

以病毒作為載體,通過病毒感染的方式將外源DNA導入到細胞中的生物學方法。

可用于難轉染的細胞、原代細胞,體內動物實驗等,常用慢病毒感染宿主細胞后將外源基因整合到染色體中構建穩轉株。需要根據細胞類型選擇合適的病毒類型,病毒載體的構建及包裝過程需要1-2個月的周期和一定的人力物力。

電穿孔法

高脈沖電壓破壞細胞膜電位,DNA通過膜上形成的小孔導入細胞。

需要儀器設備,且對細胞的損傷較大,DNA和細胞用量大,需根據不同細胞類型優化電穿孔實驗條件。

磷酸鈣法

磷酸鈣與DNA復合物吸附細胞膜從而被細胞內吞。

可對易轉染細胞如293T細胞達到較高的轉染效率,但非常不穩定,重復性差,受實驗條件的影響很大。

顯微注射法

用顯微操作技術將DNA直接注入靶細胞核。

轉染率較高,多用于工程改造或轉基因動物的胚胎細胞。需要昂貴的儀器,在導入DNA時需要進行單個細胞地注射,不適合大量細胞研究的需要。


Q:如何選擇構建穩轉株還是瞬時轉染/感染?

A:根據外源基因能否整合宿主基因組DNA,可分為穩定轉染和瞬時轉染。如果需要觀察外源基因表達后較短時間內就能檢測的功能,可以使用瞬時轉染,即在轉染后2496小時內收獲細胞;如果想長期觀察外源基因表達對于細胞功能的影響則需要構建穩轉株。穩定轉染需要進行細胞的篩選工作,與瞬時轉染相比時間長、工作量大,請根據實驗需求選擇合適的轉染方式。


Q:為什么推薦采用慢病毒感染而不是質粒轉染的方式構建穩轉株?

導入方式

導入靶細胞效率

整合位點

慢病毒感染

具備宿主范圍廣、感染效率高的特點

外源基因閱讀框可完整高效的整合至宿主基因組的轉錄活躍區域,有利于外源基因的高效轉錄與表達

質粒轉染

對于難轉染細胞轉染效率較低會導致整合幾率極低,故穩定細胞株構建耗時耗力,陽性率很低

整合位點隨機,且不能保證完整的閱讀框架整合至宿主基因組中


Q:如何確認靶細胞可以進行慢病毒介導的穩轉株構建?

A:首先對細胞進行慢病毒感染的MOI值摸索實驗,即確認慢病毒與細胞感染的合適比例,以進行后續穩轉株構建。將靶細胞接種至96孔板中,我們設定6-8個不同梯度的慢病毒MOI值感染靶細胞(進行加和不加polybrene的檢測),并取易感染的293細胞作為陽性對照。熒光顯微鏡下觀察靶細胞EGFP熒光率,拍照記錄各組MOI值下感染效率,確定感染效率達到80%以上的最佳MOI值。


Q:過表達穩定細胞株構建好之后,會出現qPCR及WB檢測目的基因沒有過表達的情況嗎?

A:我們會首先進行目的基因瞬時感染靶細胞后的qPCR和WB檢測,沒有問題再進行過表達穩定細胞株的藥物篩選工作。如果擔心抗體質量的問題沒有檢測到過表達建議客戶可以在靶蛋上融合蛋白標簽。穩轉株構建經藥物篩選完成后如果aPCR和WB檢測沒有過表達,是不允許交貨到客戶手中的,即我們確保上海銳賽提供的穩定細胞株經過qPCR和WB確切驗證有明顯的外源基因表達。


Q:穩定細胞株靶蛋白經qPCR和WB檢測有過表達但是相關功能未能得到陽性結果?

A:首先我們確保載體中靶蛋白對應的核苷酸序列經測序驗證序列正確,且閱讀框正確無誤,與標簽蛋白融合無誤,并且通過qPCR和WB的驗證,另外外源基因在哺乳動物細胞表達中一般都可以進行正確的轉錄翻譯,且翻譯后的蛋白能夠進行復雜的蛋白折疊和修飾,接近天然蛋白的結構。以上前提條件正確建立后,若蛋白本身未能獲得預期的功能,需要確認功能實驗的方法,比如是否設定陽性對照,實驗方案設計是否合理等,并且多查找相關文獻確認是否是有其他因素導致功能實驗未獲得陽性結果。


Q:收到的穩定細胞株,能夠維持多久?

A:客戶獲得的穩轉株一般需在藥物篩選濃度值的-半進行維持培養,一般可進行10代以內的檢測工作,建議客戶盡快進行相應的功能檢測實驗,不要反復存復蘇。如果長期培養不慎污染,或細胞狀態差都會影響外源基因的表達。


Q:為什么同一種細胞的陰性對照穩轉株構建過程快于目的基因的穩轉株構建過程?

A:外源蛋白的過量或內源蛋白的過低表達往往會影響到宿主細胞的生長狀態,因此往往陰性對照細胞的構建過程要快于外源基因的過表達或內RNAi穩轉株。


Q:單克隆穩轉株與混合穩轉株有何區別?

A:單克隆穩轉株是含有穩定整合外源片段的單個胞的擴增,而混合穩轉株則是由多個單克隆穩轉核構成的克,不同的單克隆其外源片的整合位點不一樣,表達效率也不同。由于體外細胞多屬病胞系,其基因組呈現不確定的特點,因此即使是同類細,不同細胞個體基因組背景都存在差異。當需去除細胞群體干擾因素的時候,推薦使用單克隆穩定細胞株,其基因組背景相對單一,對實驗結果干擾因素小。當進行系統生物學研究時,多考慮這類因素。時也是由于不同細胞個體異大,而且不同整合位點的單克隆細胞株表現出來的細行為可能不一,所以許多實驗使用混合克隆株更能去除細胞間差異造成的干擾。


參考文獻

1.R.Ian Freshney. Culture of AnimalCells:A Manualof Basic Technique and Specialized Applications[M].Wiley-Blackwell Press,2011.

2.David L.Spector,Robert D.Goldman, Leslie A. Leinwand.Cells:a Laboratory manual[M].Cold Spring Harbor Labrotary Press,1998.


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