銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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流式凋亡檢測

apoptosis detection



實驗原理


細胞凋亡(Cell apoptosis)是指為維持內環境穩定,由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同,細胞凋亡不是一件被動的過程,而是主動過程,它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用,它并不是病理條件下的損傷,而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。

細胞凋亡檢測的方法很多,我們采用的Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡的原理:磷脂酰絲氨酸(Phosphatidyl serine, PS)正常位于細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行EGFP融合、熒光素(FITC、PE)或biotin標記,以標記了的Annexin-V作為熒光探針。(如下圖7.4所示)。


7.4 Annexinv檢測細胞凋亡的原理


碘化丙啶(Propidine lodide,PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但可進入凋亡中晚期的細胞和死細胞,而使細胞核紅染。Annexin V/PI 雙染法檢測細胞凋亡,可以將凋亡早期的細胞和凋亡晚期以及死細胞區分開。


技術應用


細胞凋亡研究不僅受到基礎醫學界的重視,也日益受到臨床醫學領域的青睞。通過檢測藥物、基因或蛋白對細胞凋亡及凋亡調控基因的影響,在腫瘤防治、老年癡呆、艾滋病、自身免疫病,心肌梗塞等研究上都發揮著積極的作用。


實驗流程




實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

細胞株(凍存株或培養細胞)

及所需藥品

細胞培養信息和藥物處理方式

3周

我們提供

剩余藥物

基本實驗步驟、細胞培養照片、

流式上機圖片、數據分析結果


實驗結果展示


圖1 采用流式細胞儀Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡


TROUBLESHOOTING

實驗問題

原因

推薦解決方法

空白細胞凋亡率高?

操作不當

操作動作輕柔,收完樣后盡快上機。

檢測試劑量過大,信號過強

降低試劑用量。

采用Annexin V/PI雙染

法檢測凋亡誘導后的陽

性對照樣本凋亡率偏低?

試劑盒過期

4℃保存時間不要超過半年。

熒光淬滅

操作過程中注意避光,加完染料之后最后在2h內檢測。

丟棄細胞培養上清

細胞培養上清中含有漂浮細胞,丟棄后造成凋亡比例偏低。


常見問題FAQ


Q :常用的細胞凋亡的檢測種類有哪些?

A :凋亡檢測方法有數十種之多,主要可以分為以下幾大類: 1) DNA水平,檢測凋亡時基因組DNA的變化; 2)蛋白水平,主要檢測凋亡時線粒體和死亡受體兩大凋亡通路的變化; 3)細胞膜/細胞器膜水平,主要檢測凋亡時細胞膜成分或者膜電位的變化; 4)超微結構,主要檢測凋亡時亞細胞結構的變化。這些方法各有優缺點,必須結合具體的實驗目的,實驗條件以及實驗處理來選擇合適的分析手段。


Q :常見的細胞亡檢測方法及優缺點比較?

方法

優點

缺點

Anexin VPI雙染法:

Annexin v可結合凋亡細胞外翻的PS

蛋白。

可以準確的進行凋亡細胞的計數。

反應完畢后需在一小時內檢測,貼壁細胞吹打處理要輕柔,防止機械損傷對實驗結果的影響。不能用于組織樣本。

Sub G1 峰檢測:

凋亡細胞DNA含量的流式細胞計劃分析,分析DBA亞二倍體的形成及細胞周期的變化。

適用性廣,操作方便。

對實驗操作及實驗結果的分析能力要求較高。不能用于組織樣本。

TUNRL法:

染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產

生大量的粘性3‘ -OH末端,可在脫氧

核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用

下,對DNA的3’ 末端進行熒光劑標記。

原位染色,能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征,特別適用于組織樣本的凋亡研究。

操作要求高,組織樣本需要固定,固定方式不好可能導致背景高、信號弱。

Caspase等凋亡通路蛋白的WB檢測:未活化前以酶原形式存在于胞漿中,在凋亡的早期階段被剪切激活,可裂解相應的胞漿、胞核底物,最終導致細胞凋亡。

WB檢測方便快捷,實驗結果相對直觀,可進行半定量檢測。

注意購買質量好的抗體并優化檢測條件。


Q: Annexin V/PI雙染實驗的四個象限分別代表什么?


PI

Annexin V

代表細胞群

LL象限

-

-

正常細胞

LR象限

-

+

早期凋亡細胞

UR象限

+

+

晚期凋亡細胞或者壞事細胞


UL象限

+

-

理論上不會出現細胞;若出現有可能是操作過程中受到損害的細胞或是FACS儀器參數設置不當


A:根據費光情況劃分四個象限(見圖7.6) ,橫坐標代表綠色光(Annexin V為FITC綠色光標記),縱坐標代表Pl紅色熒光,四個象限分別命名為LL, LR, UR, UL,由于Pl不能穿過未凋亡細胞和凋亡早期細胞的細胞膜,而Annexin V可以檢測到凋亡早期外翻的PS,因此四個象限代表了不同的細胞群。

圖片1.png

圖7.6流式四象限圖


Q:流式上機檢測細胞亡每次所需要的細胞量大概是多少?

A:細胞接種到6孔板中進行前期藥物處理/轉染/感染后備用。對于個體比較大的細胞,依據實際細胞密度,使用150pxt培養血培養細胞,最終進行檢測需10^5-10^6個細胞。


參考文獻

1. Vermes I, C, Steffens-Nakken H,et al. A novel assay for apoptosis. FIow cytometric detection ofphosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J Immunol Methods 1995,184(1):39-51.

2. K o o pman G, Reutelingsperger CP, Kuijten GA, et al . Annexin V for flow cytometric of phosphatidylserineexpression on B cells undergoing apoptosis. BIood 1994, 84(5):1415-1420.

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