銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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CCK-8檢測

CCK-8gauging



實驗原理


CCK-8(Cell Counting kit-8)試劑中含有WST–8:化學名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽],它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物(Formazan),生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比,可采用酶聯免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值,間接反映活細胞數量。


技術應用


該方法已被廣泛用于大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增值實驗(1-6天)、細胞毒性實驗、藥物敏感度實驗、細胞基質黏附實驗等。


實驗流程




實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

細胞株(凍存株或培養細胞)

及處理用的藥物

細胞培養信息和藥物處理方式

3周

我們提供

剩余藥物

基本實驗步驟、細胞培養照片、CCK-8吸光度值的數據表,柱狀圖或生長曲線


實驗結果展示


圖1CCK-8法檢測待測細胞靶基因經RNA干擾后1-6天的增殖情況


TROUBLSHOOTING


實驗問題

原因

推薦解決方法

吸光度值過低?

細胞數量過低

增加待測細胞數量。

染色難度大

延長CCK-8試劑的孵育時間。

CCK-8數據重復性差

使用外圈容易揮發的孔

最外一圈的孔只加培養基,不作為測定孔用。

CCK-8沾壁

加入CCK-8后,輕輕敲擊培養板以幫助混勻。

細胞數量過多或過少

預先在1,000-100,000個/孔范圍內摸索條件。

孔內氣泡干擾酶標儀檢測

檢測前需確保每個孔內無氣泡。


常見問題FAQ


Q : CCK-8試劑盒檢測細胞增殖和毒性的優點有哪些?

A : CCK-8較傳統的MTT法優點在于1) MTT被線粒體內的一些脫氫還原酶還原成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶解液來溶解,而CCK-8產生的formazan都是水溶性的,可以省去后續的溶解步驟; 2) CCK-8檢測靈敏度更高,更加穩定; 3)酚紅和血清對其測定無明顯影響; 4)不必去上清,不必洗,滌細胞,更加簡便; 5)對細胞無明顯毒性,加入顯色后,可以在不同時間反復用酶標儀讀板,使檢測時間更加靈活,而且不影響細胞進行后續實驗。


Q :在做細胞的加藥實驗時,藥物對CCK-8測定是否有影響?如何解決?

A :1)注意如果藥物具有還原性(如維生素C),會CCK-8發生顯色反應,增加吸光度。2)藥物中的金屬對CCK-8顯色有影響:當終濃度為1mM的氯化亞鉛、氧化鐵、硫酸銅會抑制5%,15%, 90%的顯色反應,使靈敏度降級。如果終濃度是10mM的話將會100%抑制。解決辦法:首先要確認藥物是否有吸收,在含有藥物的培養基中加入CCK-8,測定450nm的吸光度,如果它的吸光度比不含藥物的培養(加CCK-8)的吸光度高,則證明藥物有影響,可在加CCK-8之前更換培養基,去掉藥物的影響。3)由于培養基中可能含有氧化還原反應的物質,在正式實驗,建議使用一個孔作一下檢測,有必要先確認培養基和CCK-8是否反應。一般正常的0D值應該0.4以下。


Q : CCK-8如何設定空白對照?

A :在不含細胞的培養基中加入CCK-8,培養一定的時間,測定450nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時,還應考慮藥物的吸收,可在不含細胞,加入藥物的培養基中加入CCK-8,培養一定的時間,測定450nm的吸光度作為空白對照。


Q : CCK-8對于不同的細胞,靈敏度是否一樣?

A :不一樣,懸浮細胞較貼壁細胞難染色。對于貼壁細胞,一般加入CCK-8培養1-4小時吸光度已經很,但對于懸浮細胞則可能吸光度較低,可以通過延CCK-8的加入時間或增加細胞數量來解決。


Q :可否采用CCK-8法進行腫瘤細胞的基質黏附實驗?

A :可以,以層粘連蛋白(Ln)包被96孔板,通過計算不同時間點孔板中貼壁細胞的數量反映細胞的黏附性。細胞的黏附性越強,則單位時間內貼于鋪有Ln板底的細胞數量越多,去除尚未貼壁的細胞后,應用CCK-8等方法計量細胞數量便可間接反映不同細胞或不同處理的細胞黏附能力的差異。


Q :可否采用CCK-8法進行藥物的IC50檢測?

A :可以,將細胞培養后按照不同濃度的藥物處理-定時間后進行CCK-8檢測,根據吸光度繪制曲線,計算該藥物抑制細胞數量一半時的濃度(IC50)。


參考文獻

1. Ishiyama M, Miyazono Y, Sasamoto K, et al. A highly water-soluble disulfonated tetrazolium salt as a chromogenicindicator for NADH as well as cell viability. Talanta 1997,44(7): 1299-1305.

2. Ishiyama M, Tominaga H, Shiga M, et al. A combined assay of cell viability and in vitro cytotoxicity with a highlywater-soluble tetrazolium salt, neutral red and crystal violet.Biol Pharm Bull 1996,19(11):1518-1520.

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