銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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動物實驗、載體構建、細胞實驗、病理學檢測、免疫沉淀、核酸蛋白分析

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腺病毒包裝

adenovirus



實驗原理


腺病毒是直徑約80-120 nm的無包膜的線性雙鏈DNA病毒(見圖3.1),可迅速感染分裂和非分裂期細胞,與細胞表面受體結合后通過內吞作用進入細胞,在細胞核孔附近聚集,并在感染后2h將腺病毒的DNA釋放到細胞核中并開始蛋白表達。通過對野生腺病毒進行改造,保留包裝信號序列,去除病毒蛋白的編碼序列,不僅增加外源基因的裝載容量,而且降低細胞毒性和機體免疫反應,從而獲得安全性更高的基因導入系統。

腺病毒包裝系統的特點:不整合到宿主細胞基因組,無插入致突變性;可進行有效擴增,獲得高滴度高純度的腺病毒。


腺病毒結構示意圖

圖3.1腺病毒結構示意圖


技術應用


體外實驗可快速有效地將目的基因或RNAi片段導入靶細胞,研究目的基因功能。

體內實驗多應用于疫苗接種、基本治療研究等。


實驗流程



病毒提供規格


腺病毒種類

客戶提供

我們提供的病毒規格

提供量

贈送陰性對照

實驗周期

過表達腺病毒

基因NCBI登陸號及含該基因的質粒載體、測序報告

低滴度10^8-10^9 IU/ml

10ml

2ml


6周

高滴度10^11-10^12 IU/ml

1ml

0.2ml

9周

高純滴度10^11-10^12 IU/ml

(推薦用于動物體內實驗)

1ml

0.2ml

10周

干擾腺病毒

待干擾基因的NCBI登陸號及靶點序信信息

低滴度10^8-10^9 IU/ml

10ml

2ml


7周

高滴度10^11-10^12 IU/ml

1ml

0.2ml

10周

高純滴度10^11-10^12 IU/ml

(推薦用于動物體內實驗)

1ml

0.2ml

11周


載體圖譜


QQ圖片4.png

            圖3.2第一次重組腺病毒中間載體圖譜                             圖3.3第二次重組腺病毒載體圖譜


實驗結果展示


QQ圖片5.png

圖3.4過表達腺病毒感染原代大鼠神經元細胞圖片及qPCR過表達檢測


圖3.5腺病毒感染各種細胞圖片展示


TROUBLESHOOTING

實驗問題


原因

推薦解決方法

過表達基因的腺病毒進行包裝后得率很低?

包裝細胞狀態不佳

請選擇狀態良好,代數較早的293細胞。

目的基因片段過長

對于3000bp以上的基因建議不要增加IRES-EGFP標記,并在后續實驗增大皿數。

腺病毒擴增后得率很低?

病毒原液質量不佳或滴度過低

適當擴增一兩代后再進行大擴。

帶有 EGFP 熒光標記的腺病毒感染細胞后無熒光

表達框不正確

確認外源基因與 EGFP 的表達框是否無誤

細胞狀態不佳

確認細胞狀態良好,并摸索合適的MOl植。

帶有 EGFP 熒光標記的腺毒感染目的細胞后無熒光很弱?

目的基因片段過長

片段過長影響共表達的EGFP熒光,建議觀察GFP陰性對照腺病毒的感染效率。

細胞狀態不佳

確認細胞狀態不好,并摸索合適的MOl值。

過表達基因的腺病毒感染目的細胞后WB檢測過表達不明顯?

表達框不正確

確認過表達基因的腺病毒載體表達框正確,未發

生提前終止。

細胞狀態不佳

確認細胞狀態良好,并摸索合適的MOI值。

干擾腺病毒感染靶細胞后qPCR檢測干擾效果不佳?

未經驗證的干擾靶點

確認靶點是否經過驗證,若無效需重新設計干擾靶點

細胞狀態不佳

確認細胞狀態良好,并摸索合適的MOI值。



常見問題 FAQ


Q: 客戶提供 RNAi 靶點進行腺病毒包裝要注意哪些要點

A:客戶提供的 RNAi 靶點序列,需明確該靶點在靶細胞的 RNAi 效率是否經過客戶驗證。如果是客戶從文獻

中查詢到的 shRNA 干擾靶點序列,其在靶細胞的干擾效率能否達到客戶要求具備一定風險,建議可進行小量

包裝驗證后再進行大量包裝實驗。若客戶無法提供 RNAi 靶點,建議客戶在我公司進行 RNAi 靶點的設計和篩

選工作,將篩選得到的最佳靶點進行腺病毒包裝工作。


Q :腺病毒載體對目的基因的長度是否有要求?

A有要求。一般基因長度超過 3000bp 的基因在載體重組過程中難度已經加大,且會影響腺病毒的出毒效率。


Q:腺病毒發貨前進行哪些質檢工作?

A:發貨前我們會對腺病毒的滴度進行檢測,采用的方法為 TCID50 方法(單位為 TCID50/ml),嚴格按照客戶的要求的滴度進行發貨;對于過表達目的基因的腺病毒,我們會將其感染 293 細胞,qPCR 檢測過表達目的

基因的表達豐度。


Q : TCID50 法檢測腺病毒滴度的操作過程及周期

A96 孔板中接種 293 細胞后,用 DMEM 將病毒液稀釋成 8 個濃度(如 10-3-10-10),每個濃度重復 10 孔,每孔加入病毒稀釋液 100μl,37℃培養 10 天,觀察細胞,根據細胞病變率計算滴度值。注意滴度檢測操作時間長, 需要感染病毒后 10 天才能觀察和計算結果 , 需客戶耐心等待準確的滴度測定結果。


Q:腺病毒的單位 VP、PFU 和 IU 各是何含義?

A:VP:病毒顆粒數(viral particle),是具備感染能力和不具備感染能力的腺病毒顆粒的總量。

PFU:空斑形成單位(plaque formation unit),是有感染能力的腺病毒的總量,即腺病毒的活性單位。

IU:感染單位(infectious unit),是腺病毒活性單位,測定方法是TCID50法。


Q : 訂制的腺病毒產品接收后如何保存和使用?

A:我們采用干冰特快專遞方式遞送到客戶手中。客戶收到后,應注意以下幾點:

1)確認泡沫塑料盒中的干冰仍有剩余,冰盒內保持低溫;2)確認泡沫塑料盒內物品與發貨樣本清單一致,腺病毒產品包裝完整,沒有破碎、滲漏;3)公司提供分裝好的腺病毒產品,短時間內不使用請凍存于 -80℃超低溫冰箱中。半年內使用完畢。4)凍存于 -80℃超低溫冰箱中的腺病毒產品使用前取出,后在室溫下解凍,解凍后放在冰浴中,并盡快使用。如果解凍后的病毒暫時用不完,滴度足夠高時(比如 1011~12TCID50/ml),4℃可保存 1~2 周。5)若每次用量很少,可對腺病毒進行分裝。


Q 包裝好的病毒在使用中要注意哪些安全性問題?

A:腺病毒的使用要求在生物安全標準 2 級 (BL2) 的實驗室進行,操作人員穿工作服、戴口罩及一次性乳膠手套。操作時應在指定的區域內使用 II 級生物安全柜;操作時動作盡量輕柔,避免產生氣溶膠和飛濺;含有腺病毒的廢液和用具可用 121℃高壓滅菌 30 分鐘;使用銳器(如注射器、刀片)時務必要小心。


Q : 腺病毒可以濃縮或稀釋嗎?方法如何?

A:可以濃縮:濃縮后的滴度以不超過 3×1012v.p/ml 為宜,過濃可能導致病毒聚集而產生沉淀。可以稀釋:可采用PBS生理鹽水、DMEM等進行稀釋,稀釋后的樣品盡量一次用完,在沒有保護劑的情況下,腺病毒在 2 ~ 8℃保存時間不能超過一周。



Q :用于體內試驗的腺病毒,是否要求純化?

A體內實驗腺病毒純化是很必要的:因為細胞裂解液包含有缺損顆粒、大量的腺病毒 fiber 和 penton 蛋白(細胞毒素)、培養基、血清以及細胞碎片。這些雜質如果被注入動物體內,會引起宿主強烈的免疫反應。另外,純化的作用還可以將病毒濃縮至一定濃度便于注射、使病毒懸浮于適于體內注射的緩沖液中。


Q :小鼠體內注射腺病毒,一只小鼠大概需要多少量?腺病毒對小鼠的半數致死劑量(LD50)大概是多少?

A:我們建議的腺病毒用量范圍在 108-10IU/ 只小鼠,客戶需進行預實驗摸索正確的使用劑量。小鼠肌注腺病毒后,3~4 天目的蛋白的表達達到高峰,一周后逐漸下降,持續表達時間在兩周左右。靜脈注射小鼠(昆明鼠),半數致死劑量 LD50 大約為 1×1011v.p./ 只;裸鼠和 SCID 鼠(嚴重聯合免疫缺陷小鼠)可能更敏感一些肌注方式的 LD50 未測到:1×1012v.p./ 只給藥,未發現小鼠死亡。


Q :可以更換特異性啟動子后進行腺病毒包裝嗎?

A:可以。常規采用 CMV 啟動子可以獲得理想的表達,若需要采用特異性啟動子進行腺病毒包裝,建議驗證該啟動子介導的表達效率后,再進行腺病毒特異性啟動子載體的構建及包裝工作。


參考文獻

1. Kozarsky, K. F., and Wilson, J. M. (1993). Gene Therapy: Adenovirus Vectors. Curr. Opin. Genet. Dev. 3,

2.Russell, W. C. (2000). Update on Adenovirus and its Vectors. J. Gen. Virol. 81, 2573-2604.

3.Wang, I. I., and Huang, I. I. (2000). Adenovirus Technology for Gene Manipulation and Functional Studies. Drug

Discovery Today 5, 10-16.

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