銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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慢病毒包裝

Lentivirus translation



實驗原理


慢病毒屬于逆轉錄病毒科,名稱源自該種病毒長達數年的潛伏期,其中最為人所知的是人類免疫缺陷病毒(HIV-1)。HIV-1直徑約120nm,含兩條正鏈RNA,可有效的進入細胞核中,對分裂期細胞及非分裂期細胞均具有很高的感染效率。對以HIV-1為基礎進行的慢病毒載體的改造,主要是去除致病基因減少輔助質粒與載體質粒的同源性,最終體現在滴度、生物安全性和外源基因表達效率上的提高,見結構示意圖。
慢病毒包裝系統特點:可通過順式作用元件將攜帶的基因運送到細胞核,將要表達的基因序列整合到細胞基因組中,后續可以通過篩選穩轉株獲得持續穩定的高表達。


3.6慢病毒結構示意圖(轉載自www.labome.com)


技術應用


體外實驗多用于感染各種難題轉染細胞,建立穩定表達或沉默目的蛋白的細胞株。

體外實驗可用于基因治療、動物模型的制備等。


實驗流程



病毒提供規格


慢病毒種類

客戶提供

病毒規格

提供量

贈送陰性對照

實驗周期

過表達慢病毒

過表達基因NCBI登陸號及含該基因的質粒載體、測序報告

低滴度10^5-10^6 TU/ml

10ml

2ml

2

高滴度10^7-10^8 TU/ml

1ml

0.2ml

3

干擾慢病毒

待干擾基因的NCBI登陸號及靶點序列信息

低滴度10^5-10^6 TU/ml

10ml

2ml

2周

高滴度1-3*10^8TU/ml

1ml

0.2ml

3周



載體圖譜


QQ圖片6.png

3.8慢病毒輔助質粒載體圖譜


實驗結果展示


QQ圖片.png圖3.9RNAi慢病毒感染骨肉瘤細胞圖片及qPCR檢測干擾效果


3.10慢病毒感染各種細胞圖片展示


TROUBLESHOOTLNG

實驗問題

原因

推薦解決方法

病毒包裝效率過低?

包裝細胞狀態不佳

采用狀態良好代數較早的293T細胞,保證包裝及輔助質粒的純度,優化慢病毒載體及輔助質粒的轉染條件。

目的基因片段過長

適當擴大包裝皿數。

帶有EGFP熒光標記的慢病毒感染細胞后無熒光?

表達框不正確

確認外源基因與EGFP的表達框無誤,若有問題則需重新構建。

感染條件不佳

確認細胞狀態良好,適當增加MOl值,摸索polybrene是否可以增加感染效率。

GFP陰性對照慢病毒感染細胞后熒光很弱?

細胞狀態不佳

確認細胞狀態良好

感染條件不佳

適當增加MOl值,確認添加polybrene是否可以增加感染效率。

靶基因慢病毒感染細胞后狀態變差?

病毒加入量遠遠超過細胞MOl

重新摸索最佳MOl值。若細胞本身對于慢病毒過于敏感建議更換病毒類型。

攜帶的靶基因表達對細胞狀態有影響

漏加酶結合物或者錯誤的使用終止液

提前終止了反應。




常見問題 FAQ


Q:根據文獻選擇慢病毒感染效率應該沒問題,為什么要做細胞感染預實驗?

A常見的慢病毒和腺病毒以感染譜廣和效果高而著稱,但是具體到不同細胞,他們對不同病毒類型的感染效率都是不一樣的,甚至于不同實驗室的相同名字的細胞對同種病毒的感染效率也是有不同的(因為細胞在不斷傳代之后,遺傳背景已經發生了變化)。在沒有判斷該細胞的最佳感染病毒類型就貿然選擇病毒是存在風險的。即使后續的細胞實驗是客戶自己完成,我們也需提醒客戶規避可能的風險。


Q:什么是MOl值?如何進行MOl值摸索?

AMOl(Muitiplicity Of Infection,感染復數)是指病毒感染細胞的比例。選擇合適的MOl值,病毒的感染效率以及目的蛋白的表達量越高,相對細胞的毒性越小。對于分裂活躍的細胞,比如293細胞,MOl=1時,95%以上的細胞均可以表達目的基因。而對于非分裂細胞,比如原代細胞,感染效率較低,MOl值可能達到200-300.我們建議通過比較不同MOl(比如0、1、5、10、50、100等)感染細胞的結果(注意摸索是否需要填加polybrene),現在適合的MOl進行實驗:可以先將培養好的細胞接種至96孔板,然后用攜帶報告基因EGFP的陰性對照慢病毒,按照不同MOl值比例感染細胞,進行MOl值摸索。


Q:慢病毒使用的安全性如何?

A慢病毒已經被全世界許多實驗室應用,至今沒有生物安全性出現問題的報道,但仍具有潛在的產生復制型慢病毒和致癌的風險,操作者在實驗中仍需要保持高度警惕!所有操作均應盡量在生物安全2級實驗室的安全柜中進行,并佩戴一次性口罩和手套,尤其要避免病毒接觸口、眼、鼻、耳、傷口等身體開放性區域,避免產生氣溶膠。顯微鏡臺、生物安全柜臺面等使用后,用75%乙醇擦拭。意外灑落的含病毒的液體,用衛生紙吸干后,用0.6%次氯酸鈉溶液浸泡被污染處1h。對共用實驗室的人員進行慢病毒安全培訓或提示。


Q:在慢性毒介導的穩轉株構建實驗中,慢病毒感染細胞后,整合入基因組中的位點有多少?

A :慢病毒的整合和加入的病毒量有關,加入量很多如MOI值達到100時可以進行多位點整合,最多5-10個,注意表達量的高低和整合位點與其在染色體上的位置有關。質粒很可能是整合在轉錄活性不強的區域,而慢病毒的偏好性在于轉錄活性非常強的區域。


Q:對于片段特別大的外源基因,載體構建和病毒包裝是否存在困難?

A基因超過2500bp,如果還要增加1300bp大小的IRES-GFP,則大小將超過3500bp。因此如果基因太大,可以考慮不要加IRES-GFP序。基因過長對于慢性毒載體的構建會造成一定的困難,如擴增產生點突變的幾率增加,擴增酶切回收效率不高;另外基因越大,病毒包裝效率過低可能導致病毒包裝失敗。


Q:訂購到的慢病毒如何保存和使用?

A 包裝好的慢病毒液全程采用干冰運輸,快遞至客戶處。請務必注意查收,收到后請打開包裝檢查干冰是否還有剩余,病毒種類和規格是否發貨單完全一致。請將慢病毒液在-80攝氏度保持,避免反復凍融,6個月內滴度不會明顯下降,建議盡快使用完畢。對于保持6-12個月以上的樣品,實驗前需重新測定滴度。使用前從-80攝氏度冰箱取出病毒,置冰上融解,待用。一次用不完的病毒液可以放在4攝氏度冰箱 中,一周內使用完畢。


Q:腺病毒和慢病毒的區別各有哪些?

區分項目

腺病毒

慢病毒

病毒基因組

雙鏈DNA

兩條正鏈RNA

是否整合宿主基因組

表達時長

瞬時表達外源基因

長時間表達,篩選后可穩定表達

是否可以擴增

可以

不可以

最高滴度

可達到10^12IU/ml

可達到10^9TU/ml

細胞感染類型

心肌細胞,神經元細胞,腫瘤細胞,原代細胞等

干細胞,原代細胞腫瘤細胞等



Q:可以對miRNA的成熟序列進行慢病毒包裝工作嗎?

A可以,請提供miRNA的成熟序列的序列信息即可。我們將進行miRNA過表達慢病毒載體的構建、包裝、滴度檢測及miRNA的qPCR檢測,詳情請見第七章技術服務內容。



參考文獻

1.Buchschacher GL Jr, Wong-Staal F.Development of Lentiviral Vectors for Gene Therapy for Human Diseasea. Blood2000,95(8):2499-2504.

2.Pandya S, Klimatcheva E, Planelles V. Lentivirus and foamy virus vectors: novel gene therapy tools Expert Opinionon Biological Therapy 2001,1(1):17-40.

3.Park F, Kay MA.Modifred HIV1 based lentiviral vectors have an effect on viral transduction efficiency and geneexpression in vitro and in vivo. Mol Ther 2001,4(3):164-173.

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