銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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WB檢測

WB



實驗原理


Western Blot是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞或者組織樣本中的蛋白,經轉膜、封閉后目標蛋白與特有性一抗結合,再與辣根過氧化物酶(HRP)標記的第二抗體起反應,經過底物顯色,分析曝光條帶的位置和灰度分析獲知目標蛋白在樣本中的表達情況(見圖4.4)。該法結合了凝膠電泳和固相免疫測定兩種技術的高特異性和高敏感性,可以對目標蛋白進行定型和半定量的分析。


44.jpg

圖4.4Western Blot實驗原理示意圖


技術應用


通過抗原抗體反應對目標蛋白的表達進行半定量檢測,還可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后續分析。WB作為一種方便可靠的研究工具,將與譜和蛋白質芯片等技術一起在蛋白質組時代發揮重要作用。


實驗流程


WB.jpg



實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

樣本、抗體

抗體說明書


3周及以上

我們提供

剩余抗體

基本實驗步驟、膠片結果、灰度分析結果


實驗結果展示


4.5.jpg

圖4.5目標蛋白過表達上調的WB結果


4.6.jpg

圖 4.6目標蛋白經RNAi下調的WB結果


TROUBLESHOOTING


實驗問題

原因

推薦解決方法

未雜出目的條帶

目的蛋白的表達量過低

提高上樣量,濃縮目的蛋液,采用更高靈敏度的ECL發光試劑盒。

一抗或者二抗效價不足

使用新配制的一抗,避免反復凍融;增加一抗或者二抗濃度,適當延長孵育時間;若陽性對照未能雜出則需更換新的抗體。

二抗品種

二抗要針對一抗種屬。

轉膜效率低

選擇合適的轉膜方式,提高轉膜效率。

背景過高

封閉條件不合適

延長封閉時間或更換封閉劑。

一抗/二抗濃度過高

降低一抗/二抗濃度并延長孵育時間。

抗體與封閉劑發生交叉反應

加溫和去污劑如Tween20。

洗膜不足

可以增加洗膜次數。




非特異性條帶

一抗質量不佳

更換其他來源一抗。

目的蛋白被修飾或降解,與目的蛋白有共同檢測表位的剪切體或同一家族成員,目的蛋白可能形成多聚體

查找相關文獻確認。

一抗或二抗濃度過高

條帶彎曲不平整

電泳遷移速度過快或遷移溫度過高

調整PH值、電壓、電泳時降低環境溫度。


常見問題 FAQ


Q:如何選擇各個公司的抗體?

A:抗體可盡量選擇進口原裝抗體,如Abcam,CST,Santa cruz等公司的抗體。根據靶蛋白的種屬(如人,小鼠,大鼠等)以及實驗用途(WB,免疫組化,細胞免疫熒光等)在各個公司的網頁上選擇合適的抗體。選擇抗體時務必注意核對基因NCBI的序列號,以防止因為基因的別名等原因導致買錯抗體。另外再購買抗體時需注意是否提供完善的售后服務,在廠商規定的時間內未能得到預期的實驗結果可將詳細的實驗信息交給抗體公司進行質量投訴,一般提供充分的實驗數據并且在保質期內可以得到抗體調換等售后服務。


Q:抗體使用有哪些注意事項?

A:使用抗體前需仔細閱讀說明書,了解抗體的保存條件以及不同用途下的推薦稀釋比例。較高濃度的抗體(>0.5mg/mL)通常性質更穩定,受生產工藝和成本控制等因素影響,不同品牌的抗體的濃度也不相同,所以購買時應注意比較,經驗不足的實驗者往往被抗體的體積迷惑,要注意相同質量下低濃度的抗體體積反而更大。


Q:為什么各個抗體都要進行 WB預實驗?

A:對WB結果有決定性影響的因素是抗體的效價和如果正確使用手中的抗體。正確使用抗體可以保證抗體效價不被過分的拮抗,與抗原更加有效的結合,從而獲得特異性和非特異性背景之間差異的最大化。每一個抗體都有其特性,因此我們必須通過WB預實驗獲得背景小,非特異性條帶少的實驗結果。

預實驗的內容如下:

1)確定一抗的稀釋比例和孵育時間;

2)選擇合適的封閉液及封閉時間;

3)調節合適的上樣量,使內參條帶灰度值趨于一致。


Q:半干轉和濕轉的優缺點有哪些?如何選擇?

A:半干轉和濕轉兩種轉膜方式各有優劣。濕轉適合所有的蛋白尤其分子量大的蛋白,轉膜效率最佳,但對試劑消耗量較大,轉膜時間長于半干轉;半干轉適合分子量小于100KD的蛋白,省時、省試劑。


Q:什么是WB的灰度半定量分析?

A:通常用Image J 或photoshop軟件對各個樣本的目的蛋白及其內參蛋白曝光后膠片的灰度值進行計算,按照灰度值的高低來半定量分析各個樣品中蛋白的表達差異。


Q:WB進行幾次重復實驗?

A:我們常規報價的服務內容為進行預實驗(摸索實驗條件)并提供一次正式實驗WB膠片結果。預實驗一般會對封閉條件,抗體濃度,孵育時間等條件進行多次重復以獲得一次最優的正式實驗結果。客戶若要求進行2-3次的生物學重復實驗,請在簽訂合同前特別說明,我們會根據工作量的增加收取相應的費用。


參考文獻

1. David Wild. The immunoassay handbook[M].Gulf Professional Publishing,2005.

2. John MW.Ehe Protein Protocols Handbook[M].Humana Press,2002.

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