銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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RNAi病毒包裝及篩選

package virus



實驗原理


與化學合成的siRNA和shRNA質粒載體相比,利用慢病毒或腺病毒表達shRNA,一方面可用于感染依靠傳統轉染試劑難于轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞,提高shRNA導入細胞的效率,另一方面病毒介導可延長RNAi的時間,尤其慢病毒感染后可以整合到宿主細胞基因組,進行穩轉篩選。

圖2.4慢病毒介導RNAi原理示意圖


技術應用


技術應用基因功能的體內外研究

病理機制研究


實驗流程




實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

靶細胞

目的基因NCBI登陸號,細胞培養信息

11-12周

我們提供

RNAi載體/菌株 

基本實驗步驟,細胞照片,病毒包裝實驗報告、RNAi篩選實驗報告


實驗結果展示


圖 1 相對定量 PCR 檢測 3 組 shRNA 慢病毒感染組相對陰性對照組目的基因的干擾效果


TPOUBLESHOOTING


實驗問題

原因

推薦解決方法

干擾病毒感染靶細胞后qPCR干擾效果不佳?

感染效率低

確定細胞狀態良好;采用合適的病毒MOI值,感染效率80%以上。

干擾病毒感染后對細胞毒性較大?

靶基因的功能

陰性對照病毒如果對細胞毒性無影響則說明靶基因的功能對細胞的增值是必需的。

干擾病毒感染后的穩轉株構建失敗?

靶基因的功能

如果陰性對照穩轉株可以構建成功說明靶基因的功能對細胞的增值是必需的。



常見問題 FAQ


Q:化學合成siRNA,shRNA質粒和shRNA病毒進行細胞實驗的優缺點?

常見的 RNAi 載體 / 方法

優點

缺點

化學合成 siRNA 轉染細胞

化學合成方便快捷,周期短。可以進行動物體內實驗研究。

干擾效果容易受到細胞轉染效率影響;siRNA 很快被細胞外排擾效果保持的時間不能超過3天。

shRNA 質粒轉染細胞

載體構建方便,可以進行擴增,避免了 RNA 操作中的特殊求,且質粒載體上可以帶有EGFP 熒光標記和篩選標記。

很多腫瘤、原代細胞轉染效率很低,不能得到很好的干擾效果。

shRNA病毒感染細胞

通過慢 / 腺病毒介導可以有效感染靶細胞 80% 以上,干擾效果達到70% 以上。其中慢病毒介導的shRNA 能整合入靶細胞的基因組中,可進行穩定株篩選工作。

病毒包裝的費用相對 siRNA 和shRNA 有所提高,包裝周期要長 siRNA 合成及 shRNA 載體構建。


Q:我提供靶細胞為什么需進行預實驗?需檢測哪些內容?

A客戶提供的靶細胞進行培養后確定其狀態,我們會進行靶基因的表達豐度檢測,確認靶基因的表達量,然后采用慢病毒或腺病毒進行細胞的 MOI 值摸索,確認靶細胞用何種病毒預計采用多大的病毒量進行感染實驗。若預實驗結果表明細胞中靶基因的本底表達本身很低則不建議進行干擾篩選工作。


Q :病毒介導的RNAi篩選工作公司作何保證?

A:首先預實驗摸索客戶提供靶細胞的 MOI 值,感染效率達到 80% 以上,從而確定病毒的包裝類型。然后設計三個干擾靶點并進行病毒包裝工作,感染靶細胞后,我們通過 qPCR 檢測,確保至少一個靶點的干擾效果大于80%。實驗結束后最佳干擾靶點的腺病毒可根據客戶的要求進行擴增;最佳干擾靶點的慢病毒可以根據客戶的要求大量包裝后提供給客戶。


參考文獻

1. Buchschacher GL Jr, Wong-staal F. Development of Lentiviral Vectors for Gene Therapy for Human Diseases.Blood2000,95(8):2499-2504.

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