銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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shRNA載體構建及篩選

ShRNA carrier



實驗原理


早期的shRNA載體多采用RNA聚合酶III型啟動子介導shRNA的表達,RNA聚合酶III型啟動子如鼠源的U6啟動子和人源的H1啟動子可以在哺乳動物細胞中表達小分子RNA。隨著miRNA干擾機制的深入研究,發展出第二代siRNA載體,即采用RNA聚合酶II型啟動子CMV表達含側翼序列的miRNA模擬物(見圖2.2)。該載體模擬miRNA的加工,表達出來的shRNA進入RISC沉默復合物的效率要比RNA聚合酶III型啟動子表達的shRNA高倍十倍,抑制效率更好,且可以和EGP協調表達,方便觀察轉染效率。


QQ圖片1.png

圖2.2RNA聚合酶II型啟動子pRS/CMV/miR圖譜


技術應用


基因功能的體內外研究

病理機制研究


實驗流程


QQ圖片2.png



實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

目的基因NCBI登錄號

6周

我們提供

shRNA載體/菌株

基本實驗步驟、細胞照片、

qPCR原始數據,擴增曲線,溶解曲線



實驗結果展示


QQ圖片3.png

圖2.3相對定量PCR檢測4組shRNA轉染組相對陰性對照組目的基因的干擾效果



TROUBLESHOOTLNG


實驗問題

原因

推薦解決方法


shRNA轉染靶細胞后qPCR檢測干擾效果不佳?

轉染效率低

保證細胞狀態,選擇合適的轉染試劑,轉染效率要求在80%以上,難以達到要求考慮用慢病毒或腺病毒介導。

轉染條件不佳

調整shRNA質粒與轉染試劑的比例。

本底表達豐度過低

本底表達豐度過低干擾效果會很不明顯。


shRNA轉染靶細胞后WB檢測干擾效果不佳?


靶蛋白的穩定性較強

延長干擾時間可改用病毒介導或進行穩轉篩選。

使用文獻提供靶點無干擾效果?

實驗無法重復文獻結果

建議重新設計4個干擾靶點進行最佳靶點的篩選工作。



常見問題 FAQ


QsiRNA,miRNA以及shRNA如何區分?

名稱

特點

   siRNA(雙鏈小片段RNA)

在RNAi通路中起作用,干擾特異基因的表達。

   miRNA(單鏈微小RNA)

由發夾狀結構經酶切后以雙鏈形式存在,最后釋放互補鏈,獲得成熟鏈后可與mRNA互補下調基因表達。

     shRNA(短發夾RNA)

人工構建至U6/H1或CMV啟動子的shRNA載體中,利用細胞內的酶切機制得到siRNA


Q:我只確定了靶基因,沒有任何靶點的情況下如何開展RNAi工作?

A在未知靶點的情況下,我們可以為客戶的靶基因設計四個干擾靶點,并進行shRNA干擾載體的構建工作。構建好的干擾載體,常規采用轉染效率高的293T細胞進行干擾篩選,若靶基因在293T細胞表達豐度高可直接進行篩選;若靶基因表達豐度過低則需要構建靶基因的真核表達載體與干擾質粒共轉染293T細胞后進行篩選。


Q:為何要進行293T細胞中靶基因的表達豐度檢測?

A我們對293T細胞的靶基因表達豐度進行qPCR相對定量分析以確定后續的干擾篩選方式;如果靶基因與內參基因的Ct值小于7則認為表達豐度較高,可以進行293T細胞的內源篩選實驗;反之則建議構建真核表達載體與干擾質粒共轉染293T細胞后進行篩選。


Q:貴公司能否保證RNAi靶點的干擾效率?

A針對人、大鼠、小鼠設計的4個干擾靶點中,我們保證在轉染效率大于80%的情況下,qPCR檢測有1個靶點的干擾效果不小于70%。


Q:不同細胞中表達同一干擾片段對靶基因的沉默效果會有差異嗎?

A會有差異:

1) 干擾片段所對應的目的mRNA的位點上可能有蛋白結合導致干擾片段無法接近目的序列,不同細胞結合蛋白的多少可能不一樣從而影響沉默效果。

2) 不同細胞目的mRNA的表達含量不一樣可能導致沉默效果會有差異。

3) Dicer、Drosha以及運輸RNAi加工中間體出核或者入核的蛋白和RISC復合物表達量會在不同細胞中有所差異。

4) 不同細胞中CMV啟動子活性可能不同,導致其表達量會有差異。


Q:可否直接提供靶細胞進行干擾效率篩選工作?

A目的基因表達豐度高的靶細胞若轉染效率可達到80%以上可以進行shRNA質粒的干擾篩選工作,若轉染效率過低,則建議在293T細胞中進行篩選,或者包裝干擾病毒液感染靶細胞進行篩選工作。


Q:針對人類基因設計的感染靶點對小鼠是否也有效?

A由于設計好的干擾靶點要求與靶基因序列完全互補配對,故大部分干擾靶點無法滿足兩個物種基因沉默的效果。即便是針對不同物種的同源基因的相同片段,由于基因在不同物種中表達有差異,也會導致不同的基因沉默效果,因此要進行靶點驗證工作。


參考文獻

1. 1 Sui G, Soohoo C, Affar EB, et al. A DNA vector-based R N A i technology to suppress gene expression in mammaliancells.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002,99(8):5515-5520.

2.Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering R NAs in mammsliancells. Science 2002 296(5567):550-553.

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