銳賽生物

靶標發現與功能驗證基因操作和基因組編輯藥物靶標開發生化/細胞水平驗證高通量高內涵分析GPCR/核受體檢測激酶檢測體外藥理學體外安全性評價藥代動力學毒理學評價藥代動力學/毒理學抗腫瘤藥理評價代謝類和心腦血管疾病藥理評價中樞神經系統藥理評價炎癥/自身免疫疾病藥理評價體內藥理學立項成果展示腫瘤個性化治療項目QPCRWB檢測ELISA檢測甲基化檢測SNP檢測高效液相色譜法(HPLC)蛋白質譜基因芯片核酸、蛋白分析服務目的基因的ORF克隆化學合成質粒載體構建siRNA的細胞轉染及篩選技術服務shRNA載體構建及篩選技術服務RNAi病毒包裝及篩選技術服務miRNA的表達載體構建及病毒包裝載體構建及篩選服務chipchip-seqIPCO-IPRNA免疫共沉淀(RIP)RNA pull down免疫共沉淀實驗服務慢病毒包裝腺病毒包裝細胞培養原代細胞分離干細胞誘導分化CCK-8檢測流式周期檢測流式凋亡檢測流式分選細胞流式鑒定細胞表面抗體活性氧(ROS)檢測線粒體膜電位檢測transwell檢測管腔形成實驗細胞黏附實驗細胞克隆形成實驗細胞免疫熒光檢測穩轉株構建雙熒光素酶檢測細胞干性成球能力磁珠分選細胞MDA(丙二醛)檢測酶活動力學檢測HDA檢測細胞實驗服務常規化學染色免疫組化(IHC)免疫熒光(IF)原位雜交(ISH)熒光原位雜交(FISH)原位末端標記染色(TUNEL)組織樣本處理拍照處理病理學檢測服務裸鼠皮下成瘤(CDX模型)人源腫瘤移植模型(PDX模型)糖尿病/肥胖模型心血管類疾病模型腎臟疾病模型肝臟疾病模型炎癥與自身免疫疾病模型呼吸系統疾病模型其他疾病模型動物實驗服務2019精品SCI2018精品SCI2017精品SCI往年精品SCI案例庫漂亮SCI案例庫科研轉化成果u.cad癌癥篩查檢測全外顯子組基因檢測其他疾病基因檢測生物信息數據分析服務腫瘤學領域研究平臺病理學中心實驗室心血管與代謝領域疾病研究平臺炎癥與自身免疫疾病領域研究平臺特發肺纖維化疾病領域研究平臺抗體藥物一體化臨床前研發平臺藥性評價平臺公司新聞價值金字塔三元悖論為客戶贏得榮譽誠覓英才內部推薦加入我們留言板聯系我們推薦朋友SCI論文發表獎勵制度科研資助POLOdeliverer3000CCK-8Annexin V-FITCAnnexin V-RFPECL 發光液細胞周期與凋亡檢測自研試劑基因質粒病毒免費送細胞庫動物飼料促銷活動

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目的基因ORF克

ORF cloning



實驗原理


ORF 克隆是指從樣本組織或細胞中抽提總 RNA,反轉錄,設計合成特異性引物后,通過 RT-PCR 擴增獲得目的基因的 DNA 序列,獲得編碼全長蛋白質序列的 DNA 序列:即從起始密碼 ATG 到終止密碼子,不含 5′ 3′UTRs 非翻譯區)及內含子序列。


技術應用


目的基因的表達研究

基因、蛋白的功能研究


實驗流程




實物

數據信息

實驗周期

客戶提供

目的基因表達豐富高的組織或細胞樣本

目的基因NCBI登錄號

4周

我們提供

質粒/菌株

基本實驗步驟、電泳圖片、測序報告


實驗結果展示


                  A                                                       B                                                              C


1 目的基因的ORF克隆實驗結果

A:樣本1和樣本2的RNA抽提電泳結果 ;B 不同擴增條件下目的片段的PCR擴增結果;C 目的片段酶切鑒定結果(T載體片段2692bp,目的片段1100bp)。



TROUBLESHOOTLNS


實驗問題

原因

推薦解決方法

RT-PCR 未能擴增目的條帶?

RNA 的抽提質量

嚴格按照標準RNA抽提步驟進行

基因表達豐度

目的基因的本底表達豐度是否過低,考慮更換表達豐度更高的組織細胞樣本。

復雜基因結構

基因序列中存在復雜的二級結構,GC 含量過高,串聯重復序列都可能導致擴增失敗。


RT-PCR 擴增非特異性條帶過多?


PCR 反應條件

建議提高退火溫度

RT-PCR 擴增目標帶過弱?

PCR 反應條件

建議增加 DNA 聚合酶的量或鎂離子濃



常見問題FAQ


Q:我怎樣獲得含有母的基因序列的質粒呢?

A :明確目的基因的種屬和基因的 NCBI 登錄號后,如果想通過調取的方式獲得則需要了解該基因在哪些組織或細胞中表達豐度較高,即通過 ORF 克隆獲得蛋白翻譯序列,然后構建至質粒中;若基因表達豐度低,難于調取可以考慮通過化學合成,即合成長片段引物,分段擴增拼接得到全長序列然后構建至質粒中。


Q : ORF 克隆服務若需客戶提供材料需要哪些注意事項?

A :通常我們可從公司的常見腫瘤細胞和正常組織的 cDNA 庫進行調取工作。若客戶提供高表達目的基因的特定組織或細胞,請注意實驗材料必須保證新鮮,即采樣后需立即放入液氮中速凍或研磨加Trizo保護液,保證RNA 無明顯降解,組織樣本提供總量大于 50mg,細胞樣本總量大于 1*10^5


Q:收到的質粒和菌株如何保存?

A:收到的質粒和菌株如需長期保存請置于 -80 ℃,菌株活化可以通過平板劃線后,挑取單克隆過夜搖菌。一般質粒較菌株更加穩定,若菌株已無法活化,可以將質粒轉化大腸桿菌,重新保存菌株,并可以抽提更多質粒以進行后續的實驗工作。


Q: cDNA 克隆與 ORF 克隆的區別是什么

A:cDNA克隆比ORF克隆多了5′或3′UTRs序列。注意5’UTR序列可能會形成復雜二級結構,影響基因的表達效率,因此一般采用 ORF 克隆進行表達研究。


Q:調取出來的序列與NCBI上相同基因名稱的序列比對時,發現兩者間有一定程度上的差異,如何解釋?

A:由于編碼基因的多選擇性剪接,一個基因通常會有多個轉錄產物(通常是長短的差異),因此可通過文獻確定最具有代表性的轉錄本;另外由于調取樣本的來源導致的基因遺傳多態性,會出現一些有義或無義的突變。我們可以通過比較多個克隆的測序結果確認這些突變并非是由于 PCR 引入的。如果酶的保真度出現問題,出現的點突變會是隨機發生的,不可能在每個克隆的同一位點發生相同的突變。無義突變不會影響蛋白的翻譯序列,一般可以接受。若懷疑有義突變會影響到蛋白功能就需要進行突變修復工作。


參考文獻

1. Joseph Sambrook, E. F. Fritsch,Tom Maniatis. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

2. Benjamin Lewin. Genes lx [M]. Pearson Education,2017.

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